התורה אומרת (במדבר י"ח, כד) שיש לתת מעשר ראשון ללויים: "כִּי אֶת מַעְשַׂר בְּנֵי יִשְׂרָאֵל אֲשֶׁר יָרִימוּ לַה' תְּרוּמָה נָתַתִּי לַלְוִיִּם לְנַחֲלָה". 

בגמרא (יבמות פו.; כתובות כו.) נחלקו האם הכוונה ללויים דווקא או אף לכהנים: לדעת ר' עקיבא מעשר ראשון ללוי; לדעת ר' אלעזר בן עזריה לכהן וללוי. הגמרא בהמשך אומרת, שעזרא כשעלה לארץ, והלוויים לא עלו אתו, קנס את הלויים. יש הסוברים שהקנס היה שהלויים לא יקבלו יותר מעשר (רמב"ם, מאירי), ויש הסבורים שהקנס היה שכעת גם הכהנים יקבלו מעשר (תוספות לפי רבי עקיבא).
הרמב"ם (הלכות מעשר, פ"א, ה"ד) כותב שתקנת עזרא היתה רק לזמנו, ואם כך כיום ניתן לתת גם ללויים (כסף משנה. ולדעת הב"ח – רק ללויים).
החזון איש (שביעית, ה', אות יב) כתב דבר מחודש מאוד. לדעתו, בזמן הזה אין חיוב לתת ללויים מעשר (ואף לא לכהנים), אפילו מטבל ודאי. טעמו: כיוון שהכהנים והלויים עולים לדוכן על פי עצמם (כל אדם שמגיע יכול לומר שהוא כהן, ואנו לא בודקים זאת), לכן, אין כיום חזקת כהונה ולוייה כשהדבר נוגע לממון. אמנם, המהרי"ט (ח"א, פ"ח) כותב שהמון העם סבור שהכהן והלוי צריכים להביא ראיה שהם כהן או לוי, אך הם טועים כי הכהן והלוי נמצאים בחזקתם, וצריך לתת להם את המתנה! (וכך פשט השו"ע, של"א, יט). החזון איש חשש מנקודה נוספת. כיוון שכל אחד יכול כיום לומר שהוא לוי, הרי שאם יתנו כיום מעשר ללויים "יתרבו הלויים" – אנשים נוספים יאמרו שהם לויים. למעשה, יש מנהגים שונים בדבר. בכל מקרה צריך להפריש מעשר ראשון, אולם, יש האוכלים אותו בעצמם ויש הנותנים לכהן או ללוי.